Lundi 08 décembre 2008 à 14h
Résumé :
Ce travail présente l’étude à l’echelle de la molécule unique de
l’intermédiaire de recombinaison appelé jonction de Holliday, et de ses
interactions avec les protéines MutS et RecG.
Nous commençons par étudier le comportement de la jonction de Holliday
soumise à une contrainte de torsion. La présence au niveau du centre de la
jonction d’une hétérologie entre les séquences recombinantes suffit à
bloquer la migration sous certaines conditions expérimentales. Ce
phénomène nous permet de détecter les hétérologies de séquences entre deux
molécules, et de déterminer leur localisation à 10 paires de bases près,
sur des molécules de 10 000 bases environ.
Nous avons ensuite étudié l’interaction entre une molécule d’ADN
présentant une jonction de Holliday et des mésappariements, et la protéine
MutS qui fait partie du système de réparation d’erreur sur l’ADN. La
présence de MutS bloque la migration lorsque le mésappariement arrive au
niveau du centre de la jonction, suggérant une fixation forte de MutS sur
le mésappariement. Cet effet disparait en présence d’ATP. Ces résultats
confirment les données disponibles concernant la fixation de MutS sur
l’ADN. Nous n’avons pas mis en évidence d’effet de MutS à distance.
La protéine RecG est une hélicase qui semble intervenir dans le sauvetage
des fourches de réplication arrêtées. Des études suggèrent sa capacité à
faire rebrousser les fourches de réplication arrêtées, à les convertir en
jonction de Holliday et à faire migrer la jonction. Nous avons étudié ces
réactions à l’échelle de la molécule unique, sur plusieurs substrats d’ADN
libres ou non en rotation, contenant des structures analogues aux
jonctions de Holliday ou aux fourches de réplication. Nous avons observé
la migration de la jonction, et la fermeture de fourche de réplication
sous l’action de l’enzyme. Cela nous a permis d’effectuer une mesure
directe de la vitesse de l’enzyme qui varie entre 150 et 200 paires de
bases par seconde, d’évaluer sa processivité qui est de l’ordre de 300
paires de bases. Le couple maximal fourni par l’enzyme a été estimé à
environ 10 pN.nm. Nous avons également étudié la dépendance de la vitesse
en concentration d’ATP, et en concentration d’enzyme. Cette dernière
suggère que l’enzyme a un mode d’action monomérique. Enfin, dans le cas
d’une jonction de Holliday, nous avons observé que la concentration en
ions magnésium libres est un facteur critique pour permettre, ou empêcher
l’accessibilité de la jonction à RecG.
RECRUTEMENT ACCES DIRECT
Le département de physique
Le Laboratoire de Physique de l’ENS 